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免疫分型

免疫分型在流式細胞術(shù)的應(yīng)用中常見，它利用流式細胞術(shù)的能力同時分析混合細胞群的多個參數(shù)。免疫分型基本的形式就是使熒光偶聯(lián)抗體與細胞表面對應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，之后利用流式細胞儀，根據(jù)細胞表面的熒光對細胞做出分析。大多數(shù)抗原都有特定的分化亞群編號或者CD編號，對應(yīng)的抗體用相同的方式命名。

大多數(shù)免疫細胞都有特定的CD標(biāo)記，這些細胞標(biāo)記稱為譜系標(biāo)記，用于定義特定細胞群，以便在每個免疫分型實驗中進行額外分析。例如T細胞標(biāo)記物(CD3, CD4, CD8)， B細胞標(biāo)記物(CD19, CD20)，單核細胞標(biāo)記物(CD14, CD11b)和NK細胞標(biāo)記物(CD56, CD161)。

除了定義細胞群的譜系標(biāo)記外，還使用其他標(biāo)記來描述每個細胞群的特征。這些標(biāo)記包括激活標(biāo)記(CD69、CD25、CD62L)、記憶標(biāo)記(CD45RO、CD27)、組織歸巢標(biāo)記(α4/β7)和趨化因子受體標(biāo)記(CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6)等。通常，免疫分型還針對細胞內(nèi)標(biāo)記物，如FoxP3(定義Treg細胞)、細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2定義Th1細胞)、增殖標(biāo)記物(Ki67、CFSE)和抗原特異性標(biāo)記物等。

抗原特異性反應(yīng)

在抗原特異性反應(yīng)中，使用特定抗原刺激細胞，之后通過MHC多聚體來尋找細胞因子產(chǎn)生、細胞增殖、細胞激活、細胞記憶或抗原識別等。MHC多聚體是化的MHC單體(MHC-I或MHC-II)以四聚體、五聚體或右旋聚體的形式結(jié)合在熒光鏈霉親和素骨架上。這些MHC多聚體被“裝上"特定的抗原，之后與識別該抗原的T細胞結(jié)合，用來表明T細胞對特定抗原的反應(yīng)水平?？乖禺愋苑磻?yīng)通常用于疫苗研究。

胞內(nèi)因子檢測

胞內(nèi)細胞因子檢測通常使用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(Brefeldin A或Monensin)處理細胞2-12小時，使細胞產(chǎn)生的各種細胞因子在胞內(nèi)積累，便于更好地檢測。在這個處理過程中，細胞可以被各種抗原刺激(例如疫苗中的多肽)，以檢測細胞的免疫反應(yīng)。在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑處理完畢后，對細胞進行活力標(biāo)記和細胞表面標(biāo)記染色，之后進行固定和滲透，以使細胞因子抗體進入細胞內(nèi)染色。

細胞增殖檢測

細胞增殖可以通過幾種不同方法來測定，這些方法可靶向與細胞增殖相關(guān)的事件，例如將胸苷類似物(BrdU)摻入復(fù)制中的DNA、可遺傳染料的世代跟蹤、增殖相關(guān)抗原(Ki67、PCNA)的表達檢測等。

細胞凋亡檢測

流式細胞術(shù)利用與凋亡相關(guān)的級聯(lián)事件的靶點進行細胞凋亡檢測：膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)靶向易位的細胞質(zhì)膜進行染色；TUNEL(TdT dUTP Nick End Labeling)靶向內(nèi)切酶消化的DNA進行標(biāo)記；抗體和染料靶向半胱天冬酶（Caspases）的激活；確定線粒體膜電位的染料靶向線粒體凋亡；Hoescht 33342靶向細胞核中的染色質(zhì)凝聚。

Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，能夠與細胞凋亡過程中被轉(zhuǎn)運到細胞膜外表面的磷脂酰結(jié)合。Annexin V應(yīng)與排除活性染料(如碘化丙啶)聯(lián)合使用，以確保Annexin V與磷脂的結(jié)合發(fā)生在細胞膜外表面。

TUNEL是一種利用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)的能力，用dUTP(脫氧尿苷三磷酸)或BrdU標(biāo)記與凋亡相關(guān)的DNA斷裂末端的技術(shù)。dUTP或BrdU用熒光色素標(biāo)記用于檢測，在數(shù)據(jù)采集之前用DNA染料對細胞進行反染色

Caspase信號通路會在大多數(shù)細胞凋亡過程中被激活，其產(chǎn)生的活化Caspase 3能夠被相應(yīng)的細胞內(nèi)染色劑和抗體特異性結(jié)合。

檢測線粒體凋亡的方法是使用染料JC-1來檢測線粒體膜電位。此外，有一種抗體可針對APO2.7——一種僅在細胞凋亡過程中表達且定位于線粒體膜上的蛋白。