四環(huán)素類檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的四環(huán)素類藥物（Tetracyclines，TCs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的四環(huán)素類藥物和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含四環(huán)素類藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中四環(huán)素類藥物的殘留量。
2 四環(huán)素類檢測試劑盒技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織、肝臟、雞蛋………………0.3ppb
蜂蜜………………………………2ppb
尿樣………………………………0.5ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
四環(huán)素………………………………100%
二甲胺四環(huán)素………………………125%
吡四環(huán)素……………………………110%
金霉素………………………………100%
脫甲基金霉素………………………35%
土霉素………………………………58%
強力霉素……………………………45%
 2.5 樣本回收率：
組織、肝臟、雞蛋…………85±20%
蜂蜜…………………………75±20%
尿樣…………………………80±20%
3 試劑盒組成
酶標板………………………96孔
標準品（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標準品（黑蓋）：1ppm…………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：三酸、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：1%三酸溶液
    稱取1g三酸加去離子水100ml溶解。
配液2：復(fù)溶液
    將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法（不用過柱）
1）用均質(zhì)器均質(zhì)組織、肝臟、雞蛋樣本；
2）稱取2±0.05g樣本于50ml離心管中，加入6ml 1%三酸溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3）取出1ml上清液于另一試管中，加入1m甲醇，振蕩1min，室溫4000r/min以上，離心10min；
4）取1ml上清液在50-60℃氮氣或空氣吹干，加入1ml復(fù)溶液溶解殘留的干燥物；
5）取50 µl用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：6    檢測下限：0.3ppb
5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1）準確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入2ml 1%三酸，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
2）取出100ul上清液于另一試管中，加入1900ul復(fù)溶液稀釋，混合30s；
3）取50µl用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測下限：2ppb
5.3.3 尿樣本的處理方法
1）用復(fù)溶液將尿樣10倍稀釋（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
2）取50µl稀釋的尿樣用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.5ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
制備四環(huán)素標準應(yīng)用液：將各濃度標準品分別用稀釋好的復(fù)溶液10倍稀釋成應(yīng)用液，現(xiàn)配 現(xiàn)用。（如：分別取50ul各濃度標準品加450ul稀釋好的復(fù)溶液，混合均勻，即成各濃度標準品的應(yīng)用液。）
6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標準品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。